双特异性抗体下游纯化的当前趋势和挑战
本文节选自“Current trends and challenges in the downstream purification of bispecific antibodies”，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
简介
双特异性抗体(bsAb)显示出了新的功能，通过识别和靶向两种不同的抗原，在提高药物疗效方面提供了极大的希望。bsAb的巨大治疗潜力推动了迄今为止报道的超过50种不同形式的重组bsAb的开发。然而，与众多介绍了各种不同形式的bsAb的详细综述以及旨在最大限度地降低产物相关杂质的上游平台技术和其相应的治疗应用的文章相比，目前关于这类重要的抗体类别的下游纯化的综述相对有限，这部分是因为关注这类抗体纯化的文献较少。
目前许多bsAb的下游工艺方法都是建立在已经相对成熟的单克隆抗体(mAb)的纯化方法之上，因为这些抗体之间无疑有一些结构上的相似性，而且前者至少来自后者的一部分(图1)。尽管优化后的mAb下游工艺方案是纯化bsAb的一个很好的起点，由于其内在结构和相伴的物理化学性质(图1)的差异，以及bsAb相关的副产物的存在，进一步的优化不能完全消除。理解这一点将有助于鉴别潜在的挑战，从而为其下游工艺设计最佳策略。为此，本文将综述bsAb及其副产品的关键结构特点，介绍目前bsAb的主要纯化方法，并提出相应的解决方案，同时对未来的工艺发展提出展望。
bsAb及其主要副产物的关键结构特点
这里，我们将根据其结构考虑三大类bsAb，即(i)非对称的、(ii)对称的以及(iii)基于片段的bsAb(图1)，因为它们的结构特点对其下游工艺策略有重要的含义。尽管bsAb可能是二价的，针对每一个抗原有一个结合位点(1+1)，通过在链上整合额外的结合位点，可以提高价数，以达到三价(如1 + 2或2+ 1)或四价 (如2 + 2)，如图1中所示的1b-d。
非对称bsAb (图1b) 通常具有源于两个不同亲本mAb的重链(HC)和轻链(LC)，其中部分或全部的LC和/或HC也可以在可能的情况下设计为在两臂上相等，以尽量减少错配。另一个非对称bsAb的例子是抗原结合片段(Fab) × 单链可变片段 (scFv) 形式，其中，来自不同亲本mAb的scFv取代免疫球蛋白G上的Fab区域。与非对称bsAb相似，对称bsAb也具有Fc区域 (图1c)，并通过含有具备额外抗原识别域 (如附加在抗体上的scFvs)的相同HC 而保持对称性。基于片段的bsAb(图1d)可以说是具有最多样化的形式组成，其通过不同的链和铰链的组合而实现。这里所示的串联scFv形式由两个含一个铰链的scFv组成，每个铰链将LC连接到HC，另一个铰链将两个scFv连接在一起。类似的形式是双链抗体（diabody），其中一个scFv的LC连接到另一个scFv的HC，而不是它自己。
尽管bsAb价数的增加为治疗目的带来了各种优势，bsAb特异性副产物对其下游工艺提出了独特的挑战。这类杂质的例子包括HC和LC错配产物以及碎片和聚体，图2以非对称bsAb为例，尽管在其它形式中也可以产生类似类别的杂质。由于在生产细胞中有不止一种不同的HC和LC共表达，HC和LC的错配可产生大量大小和性质相似的非期望、非功能性或单特异性抗体(图2)。如果允许任意配对，这些错配产物可占总质量的90%。为了减少错配的产物，bsAb产生所采用的方法之一是偏向于所需bsAb的形成，例如，通过knob-in-hole (KiH)方法，而另一种方法是采用分子设计技术，以便在随后的下游工艺步骤中实现更容易去除错配副产物的能力，其中一个例子是ProteinA结合切除的嵌合Fc序列 (Fc*)。前者没有提供一种直接的方法来纯化确实发生的错配异构体，而后者会导致生产力下降，因为除了所需的bsAb外，细胞的能量还被用于制造异构体。
图2. 此处所示因HC错配 (浅蓝色虚线框)、LC错配(浅红色虚线框)、片段 (浅绿色虚线框) 和聚体 (浅紫色虚线框)所形成的杂质是所需非对称bsAb中的代表性杂质，同时，在相应的深色实线框中列出了去除这些杂质的策略。(1) 对于Fab × scFv bsAb，差异KappaSelect亲和以及基于CH1的层析方法已被证明是有用的；(2)通过使用阳离子交换层析法，并利用接近bsAbpI的碱性pH值，可以从scFv-IgG bsAb目标物中分离出双链小体-IgG错配产物；(3) 疏水和混合模式填料已被提出用于将某些同型二聚体错配产物从其bsAb目标物中分离出来。这里列出的例子还不详尽。
不需要的片段构成了另一组常见的不需要的副产品，例子包括½ (少一个HC和少一个LC的抗体)和¾(少一个LC的抗体)抗体(图2)。另一组主要的副产品是总体上更高水平的聚体的存在。这已在多种类别的bsAb中有报导。尽管有研究称，与亲本的传统免疫球蛋白相比，基于片段的bsAb中Fc区域的缺失使抗体更容易聚集，对称bsAb也被证明具有更高的聚集倾向，已观察到高达50%的聚体，这至少在某些情况下可以部分归因于分子间结构域的交换，而这是由于链长和灵活性的增加。在某些情况下，这些bsAb的聚集倾向也反映在它们作为包涵体的表达中。
用于bsAb的一般下游纯化工艺
本节旨在介绍目前用于纯化bsAb的常见工艺和方法，表1和表2总结了一般的纯化细节，具体的杂质去除方法和策略将在接下来的章节中详细介绍。由于报道了大量不同的bsAb形式，这里列出的不同类型bsAb的纯化方法的细节绝不可能详尽无遗；我们试图尽可能地将以bsAb的纯化作为工作重点的研究纳入进来，包括已经获批的或正在临床试验中的bsAb的纯化方法。虽然比较不同纯化方法的效率是最理想的方式，但不同的上样量、培养液质量、层析填料以及定量方法使得以一种有意义的方式对每种方法进行比较特别具有挑战性。
表1. bsAb纯化方法概述，利用亲和层析作为第一个捕获步骤，除了#标注部分，其中各自的亲和层析步骤被用作精纯步骤。
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表2. bsAb纯化方法概述，利用电荷、尺寸、疏水性和基于混合模式的分离技术作为精纯步骤，除了**标注部分，其用作第一个捕获步骤。从包涵体回收bsAb或沉淀法也被用作第一步纯化步骤，除了^标注部分，其针对经过低pH(pH3.0)处理的Protein A洗脱液进行。
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原文：S.W.Chen, W.Zhang, Current trends and challenges in the downstream purification of bispecific antibodies. Antibody Therapeutics, 2021 Apr; 4(2): 73–88.
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